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 WB检测样本前处理：细胞裂解和蛋白提取

从细胞或组织（新鲜或冷冻）中提取蛋白质的所有步骤必须在2-8°C下进行。

蛋白质提取实验方案步骤

将含有细胞的培养皿中的培养基丢弃，用冰冷的PBS洗涤细胞。

丢弃PBS，加入冰冷的裂解缓冲液。

使用冷塑料细胞刮刀刮擦细胞。收集微量离心管中的细胞。

将微量离心管中的内容物在4℃下搅拌30分钟。

将离心管在4℃下以16,000G离心20分钟。将上清液收集在新管中并置于冰上。丢弃沉淀物。

从细胞悬液提取蛋白质

将细胞悬液在4℃下以2,000G离心5-7分钟。细胞将聚集于试管底部，弃去上清液。

向细胞沉淀中加入冰冷的PBS，并在4℃下以2,000G离心5-7分钟洗涤细胞。

向细胞沉淀中加入冰冷的裂解缓冲液。将微量离心管中的内容物在4℃下搅拌30分钟。

将离心管在4℃下以16,000G离心20分钟。将上清液收集在新管中并置于冰上。丢弃沉淀物。

从组织中提取蛋白质

在冰上切割要研究的组织。将组织转移到圆底离心管，浸入液氮快速冷冻。

对于5 mg组织，加入300 μL冰冷的裂解缓冲液，使用电动匀浆器均化。在均质化过程中另再添加300-600 μL裂解缓冲液。

在4℃下搅拌内容物2小时。

将离心管在4℃下以16,000G离心20分钟。将上清液收集在新管中并置于冰上。丢弃沉淀物。

标准化样品总蛋白质浓度

取少量裂解物进行蛋白质估算测定。

蛋白质估算可以使用考马斯蛋白质测定试剂（货号：27813）、BCA 测定、280nm吸光度、或用于总蛋白定量的DirectDetect® 红外光谱仪进行。

通过与标准样品比较确定未知样品的蛋白质浓度，确保将标准样品稀释到与未知样品相同的缓冲液中。

将适当体积的裂解物转移到微量离心管中，使得所有样品都含有相同的总蛋白质浓度。

加入足够的冰冷裂解缓冲液，使所有裂解物具有相同的体积。


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